作者簡介：顧建文，祝輝，解放軍第306醫(yī)院，成都軍區(qū)藥檢所。
蛹蟲草為子囊菌亞門，麥角菌目，麥角菌科、蟲草屬的模式種。學名為Cordycepsmilitaris，又名北冬蟲夏草、北蟲草等，有部分地區(qū)亦稱為踴蟲草，世界性分布天然資源數量很少。1950年，德國科學家Cunningham觀察到被蛹蟲草寄生的昆蟲組織不易腐爛，進而從中分離出一種抗菌性物質，定名為蟲草素。由子座（即草部分）與菌核（即蟲的尸體部分）兩部分組成的復合體。冬季幼蟲蟄居土里，菌類寄生其中，吸取營養(yǎng)，幼蟲體內充滿菌絲而死。到了夏季，自幼蟲尸體之上生出幼苗，形似草，夏至前后采集而得。中醫(yī)認為，蟲草入肺腎二經，既能補肺陰，又能補腎陽，主治腎虛，陽痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時平衡、調節(jié)陰陽的中藥。蛹蟲草為我國傳統藥用大型真菌，其藥用活性成分主要為蟲草素。其作為冬蟲夏草的替代品之一，蟲草素含量較冬蟲夏草高約3到6倍。據研究，蟲草素有著重要的藥用功效和生化用途，因為具有較大的開發(fā)利用前景。蟲草素的分子式為C10H13O3N5，分子量為251.24，且能溶于水及熱乙醇、甲醇，不溶于苯、乙醚、氯仿。目前蟲草素純品在國際市場上的價格約為2000美元/g，其經濟效益非常可觀，故其提取、分離、純化的方法很值得研究。
人工蛹蟲草
蛹蟲草是一種具有滋補作用的中藥和營養(yǎng)品，其所含的蟲草素、蟲草多糖具有獨特的藥理及保健作用。蛹蟲草人工栽培成功以來藥理和毒理等方面的研究得到了廣泛的進展。研究表明人工蛹蟲草和冬蟲夏草有著極相似的作用，無毒副作用。近年來，隨著人們對人工蛹蟲草的滋補保健功效和多種藥用價值的認識，其開發(fā)利用研究倍受關注，并在藥理、有效成分等方面取得了很大的進展。
蟲草素
蟲草素具有抗病毒、抑菌、明顯抑制腫瘤生長，與環(huán)磷酰胺有明顯的協同作用，并有降血糖的作用。蟲草素的分子式為C10H13O3N5，分子量為251.24，且能溶于水及熱乙醇、甲醇，不溶于苯、乙醚、氯仿，紫外光的最大吸收波長為259nm。
蟲草素的結構
Cuningham等首次從蛹蟲草中分離出蟲草素，采用紫外光譜特征進行鑒定，確定最大吸收波長。同時，用其半寬度、波峰與波谷的比值確定為核苷類化合物。
Frederiksen等從蛹蟲草培養(yǎng)基中分離出蟲草素采用紅外光譜進行了分析確定。
陳順志等也才用了紫外和紅外光譜對從蛹蟲草固體培養(yǎng)基分離出的新化合物進行了結構鑒定，結果與蟲草素的文獻報道一致。同時，還應用了超導核磁共振法進行了分析，進一步確定其為蟲草素結構如下：
蟲草素的藥理作用
抗菌、抗病毒作用，蟲草素是一種核苷類抗生素，具有較好的抗菌、抗病毒功效。焦彥朝等報道，蟲草素對枯草桿菌、鳥結核桿菌及牛型結核分枝桿菌有抑制作用，鄭藻杰等研究發(fā)現，蟲草素能抑制鏈球菌、鼻疽桿菌、炭疽桿菌、豬出血性敗血癥桿菌及葡萄球菌等病原菌的生長。此外，蟲草素還對石膏樣小牙孢癬菌、羊毛狀小牙孢癬菌及須瘡癬菌等皮膚病致病性真菌亦有抑制作用。同時，蟲草素還對人體免疫缺陷性病毒HIV-I型的侵染及其反轉錄酶的活性亦有抑制作用。
增強免疫功能和預防心血管疾病，據Zhou等報道，蟲草素能明顯促進人外周單核細胞IL-10的分泌和IL-10mRNA的表達，同時，對誘導產生IL-2的植物血球凝集素和外周血液單核細胞的擴增有抑制作用。IL-10能強烈抑制淋巴細胞和單核細胞，從而能使機體免于過度的免疫病理損傷，所以，蟲草素可以通過IL-10的作用對自身進行免疫性調節(jié)。另外，吳畏等報道，蟲草素能抑制蛋白質激酶活性，抗核苷磷酸化酶對糖基的裂解。對體液免疫具有調節(jié)作用，能增加脾臟重量，加速肝臟核酸和蛋白質更新速度；具有抗缺氧、增加心肌營養(yǎng)血流量及降低血清膽固醇和β-酯蛋白的作用，能明顯增加冠脈血流量，降低冠脈、腦及外周血管阻力，而且對核酸的甲基化有抑制作用，能預防腦血栓和心血管疾病發(fā)生。
抗腫瘤作用，蟲草素對艾氏腹水癌、人鼻咽癌KB細胞、人宮頸癌HeLa細胞、小鼠黑素瘤細胞及Lewis肺癌細胞等具有明顯的抑制作用。蟲草素對人肝癌SMMC-7721細胞增值的影響試驗，用質量濃度為0.8 g/L的蟲草素，分別作用腫瘤細胞24、48、72 h后，腫瘤細胞生長抑制率分別為30.6%、49.8%、81.4%，說明蟲草素具有明顯的抑制腫瘤細胞生長作用；吳洪臻等[15]用低劑量[30 mg（/ kg·d）]和中劑量[60 mg（/ kg·d）]蟲草素及陽性藥物環(huán)磷酰胺[20 mg（/ kg·d）]作用小鼠9 d，進行S180瘤細胞實驗，抑瘤率分別為45.72%、49.11%和55.91%。若將蟲草素和環(huán)磷酰胺兩者聯合使用，對S180抑瘤率可提高到88.55%。由此可見，蟲草素可以增強環(huán)磷酰胺的抗癌作用，提示蟲草素可以作為臨床抗腫瘤藥物的輔助藥物。
降血脂作用，朱平等報道，將蟲草素20 mg/kg與陽性藥物——力平之25 mg/kg作用于高血脂模型小鼠，結果表明，它們降低血清甘油三脂的效果相當，所以，蟲草素可應用于高血脂癥患者的輔助治療。
調節(jié)胰島素分泌作用，巫冠中等探討了蟲草素對大鼠離體郎罕氏胰島細胞分泌胰島素的影響。認為蟲草素可抑制由糖誘導的胰島素釋放，并且降低特異性磷酸二酯酶抑制劑Qrg9935或腺苷酸環(huán)化酶激活劑Fotskolin促進胰島素分泌的作用。結果提示，蟲草素對胰島素分泌的抑制作用是通過A1受體介導，并非經P-位點產生對腺苷酸環(huán)化酶的抑制。但其在臨床糖尿病病人的使用中，能否影響胰島素分泌尚需進一步研究。
清除自由基作用，機體內產生的自由基起主要作用的是SAFR和HFR，蟲草素對SAFR具有較強的特異性清除作用，而蟲草素和蟲草酸等組分共同作用能更有效的清除HFR。
已有不少以蟲草素為主的藥品、保健品及化妝品投放市場。陳順志等采用生物技術和超臨界萃取技術成功獲得了蛹蟲草中的蟲草素，經加工處理研制成蟲草活性素軟膠囊。據報道，美國已將蟲草素作為抗癌、抗病毒新藥進入臨床試用。而我國由蟲草素合成的治療白血病新藥也已進入Ⅰ期臨床階段。所以，隨著科學技術的飛速發(fā)展，蟲草素的獨特功效將會進一步的被發(fā)掘和利用，因此，其具有重要的開發(fā)和應用價值。
蟲草素的提取技術
1水提法
鐘艷梅等以人工蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基為原料，采用索氏提取法提?。簻蚀_稱取處理好的樣品各10g，共4分，分別加入水、75%乙醇、95%乙醇、和無水乙醇做提取劑，在沸水浴中抽提8小時，收集提取液，除雜、濃縮，離子交換柱分離，收集洗脫液，分別用紅紫酸胺反應定性定量鑒定蟲草素的含量。發(fā)現蟲草素得率分別為：0.0122%、0.0078%、0.0053%和0.0052%。
車振明對人工蛹蟲草子實體及培養(yǎng)基中蟲草素進行提取、純化及純度鑒定。結果，經過對蛹蟲草子實體及培養(yǎng)基的粉碎、石油醚脫脂、80-85℃水浴12小時、調節(jié)等電點沉淀、732-NH4離子交換樹脂的分離、濃縮、4℃下低溫結晶，可得到一定純度的蟲草素晶體。
2超臨界萃取法
超臨界流體萃取技術是近年來迅速發(fā)展被人們所認知，而稱之為“綠色分離”的一種新型分離技術。CO2作為最常用的超臨界流體，具有操作溫度低、分離效率高，無毒、無溶劑殘留、無二次污染等優(yōu)點，較之于傳統提取方法，超臨界CO2萃取克服了前者提取時間長、溫度高、系統開放等缺點，可同時萃取出較多的極性組分，非常適合于生物資源有效成分的提取分離。
陳順志以食用真菌蟲草或北蟲草人工培養(yǎng)后的發(fā)酵物為原料，采用超臨界技術萃取有效成分，同時結合常規(guī)方法除去雜質、濃縮、結晶獲得蟲草素，并對蟲草素的紫外與紅外光譜特征與標準品進行了驗證，表明所提取結晶純度大于98%。
3酶法提取
在中藥提取過程中，溶劑需要克服來自細胞壁及細胞間質的傳質阻力。選用合適的酶對中藥材進行預處理，能分解構成細胞壁的纖維素、半纖維素、及果膠，從而破壞細胞壁的結構，產生局部的坍塌、溶解、疏松，減少溶劑提取時來自細胞壁和細胞間質的阻力，加快有效成分溶出細胞的速率，提高提取效率，縮短提取時間。而且反應條件溫和，產物不易變性，降低成本，環(huán)保節(jié)能。
謝紅旗研究UPLC測定蟲草素的方法及酶法提取蛹蟲草中蟲草素的工藝條件。對酶種類、酶用量、酶解溫度、酶解時間、酶解pH值進行考察，確定最佳提取工藝。結果，中性蛋白酶提取蛹蟲草中蟲草素的最佳工藝為：酶用量1.5%，酶解溫度50℃，酶解pH值5.5，酶解時間60min。該工藝條件下，蟲草素提取得率為0.732%，與未加酶的熱水浸提相比，蟲草素提取得率增加6.2倍。
4超聲法提取
超聲法提取蟲草素的原理是超聲波在液體中產生沖擊波和射流破壞細胞和細胞膜結構，從而有助于蟲草素的釋放與溶出，同時超聲波的熱效應時水溫基本保持恒定，對原料有水浴作用。因此，超聲法大大縮短了提取時間，提高了蟲草素的提取率和原料的利用。
黃子琪就超破碎法用于蛹蟲草菌絲體中蟲草素提取時應采取的工藝條件進行研究。采用單因素分析和正交設計實驗分別研究各因素對蟲草素提取得率的影響。當以提取溶劑為水：乙醇（1:1，v/v）、pH=7.0、功率600W、提取時間35min的條件進行提取時，蟲草素的提取得率最高。
5微波提取法
微波提取技術是利用頻率為300-300,000MHz的電磁波輻射提取，在交頻磁場、電場作用下，提取物內的極性分子取向隨電場方向改變而變化，從而導致分子旋轉、振動或擺動，加劇反應物分子運動及相線間的碰撞頻繁率，使分子在極短時間內達到活化狀態(tài)，比傳統加熱更均勻、高效。
周英彪以蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基為原料，正交試驗確定微波加熱提取蟲草素的最佳工藝。結果，微波提取蟲草素的最佳條件是微波強度P50，固液比1:20，提取時間2min，提取次數2次，微波提取液經2次制備型高效液相色譜分離純化后蟲草素純度達到95.2%。
夏敏對蛹蟲草固體培養(yǎng)物中的蟲草素進行微波提取，用HPLC法測定提取液中的蟲草素含量，通過正交試驗，確定了微波提取蟲草素的最佳條件為：提取液用量10ml，固液比1:20，中火處理3min，樣品中蟲草素的測定值達12.16mg/g。
蟲草素的純化技術
Cunningham等首先報道了從被冬蟲夏草培養(yǎng)液中分離蟲草素。他們以培養(yǎng)液濾液經Dowex-I-CL-1離子交換樹脂柱和活性炭柱層析，得到蟲草素單體。
韋會平等采用連續(xù)逆流提取、732陽離子交換樹脂柱層析和結晶三步從蛹蟲草大米培養(yǎng)基中提取蟲草素，對每一步的工藝參數進行了系統優(yōu)化，得到蟲草素產品的純度達98.0%以上。
鐘運俊等以蟲草素的吸附與解析特性為指標，篩選不同樹脂；采用結晶法成功的獲得蟲草素晶體并對其純度進行鑒定。結果發(fā)現，D001大孔強酸離子交換樹脂吸附量、吸附率最高，直接洗脫后純度可以達到80%左右，適合蟲草素的純化；重復結晶得到蟲草素晶體純度達到98%以上。
He Ni等利用一種新型柱層析的方法從蛹蟲草液體培養(yǎng)基中提取和純化蟲草素，該方法提取率高，純化效果好，蟲草素純度達到98%，且所耗溶劑量最小，可以用來定量分析從液體培養(yǎng)基中提取的蟲草素含量。
根據文獻，柱層析法是現在應用最廣的蟲草素純化方法。該法工藝流程比較簡單，所得蟲草素的純度高，有較高的工業(yè)應用價值，其缺點在于提取率較低，因此，篩選吸附能力較強及吸附量較多的樹脂是這種方法能否得到應用的關鍵。
蟲草素的研究展望
由于蟲草素具有明顯的藥理活性，已有不少以蟲草素為主的保健品、保健食品、化妝品、藥品投放市場，并引起國內外專家的重視。據報道，在美國已將蟲草素作為抗癌、抗病毒新藥進入臨床使用。然而由于其成分復雜，有效成分低，大大影響了該藥的臨床療效以及市場的進一步擴大。因此，提取和純化蟲草素已成為相關機構爭相研究的重要方向。隨著研究的深入蟲草素的商業(yè)價值更是不可估量。
蛹蟲草是一種名貴的中藥和高級滋補品，性味甘平，益肺腎，補精髓，止血化痰，具有重要的藥用價值。為了滿足社會需求，近年來，對人工蛹蟲草的培養(yǎng)研究及其提取產物的研究與開發(fā)得到重視。
著眼于充分利用資源，本課題以人工蛹蟲草子實體作為研究對象，探討從中提取蟲草素的工藝條件。根據蟲草素的分子量和化學性質，研究分離和純化的影響因素，為從人工蛹蟲草子實體中分離、提純蟲草素的工業(yè)化生產提供理論依據及實驗基礎。
目前，隨著生活節(jié)奏的加快和思想觀念的轉變，人們越來越注重自身保健，人工蛹蟲草的主要有效成分蟲草素在醫(yī)藥市場前景良好。同時隨著人工培養(yǎng)蛹蟲草產業(yè)規(guī)模的不斷擴大，企業(yè)對于如何將培養(yǎng)過程中的產物變廢為寶、提高投入與產出的比例的需求越來越迫切，因此該研究課題具有良好的市場基礎和開發(fā)前景，其產業(yè)化必然會帶來良好的社會效益、經濟效益和環(huán)境效益。
